1. 高质量的栓线是提高MCAO大鼠模型成功率的关键

对栓线的要求：（1）栓线直径要和大鼠体重匹配；（2）栓线的头端一定要圆钝，而且头端的直径要和栓线的直径匹配；（3）栓线要软硬适度，太软，不易插入，太硬，易刺破血管；（4）只要大鼠体重能控制在较小的范围内，则每根栓线的直径和头端直径必须一致。要达到上述要求，对初学者甚至是较熟练者而言都是很难做到的。

2.如何避免栓线插入翼腭动脉
大鼠仰卧时，ICA从CCA分出后下行（向背侧）约5mm又分为两支A，即走向乳突泡（Mastoid bulla）的 翼腭A和进入颅内的ICA的延伸部分。因为翼腭A的走向几乎和分支前的ICA走向相同，而ICA的延伸部分则是改向头侧走行，所以插线时会很自然的进入翼腭A，需反复拔插几次，碰巧后才能进入颅内，非常痛苦。最初我干脆将翼腭A也分离，然后夹闭或结扎翼腭A的起始部，结果是手术很难操作，效果也不理想。后来又改用另一方法，即在栓线将要插入翼腭A前，用镊子将ICA轻轻往头侧推一下，使ICA和其延长的分支成一直线，同时顺势插线，可很容易的进入颅内。随着经验值的增加，发现完全可以通过改进栓线形状达到目的，即使栓线有一定程度的弯曲，插线时只要保证栓线向操作者方向弯曲，闭着眼睛也能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。

3.如何提高脑缺血的成功率！
经常有朋友向我诉苦，费九牛二虎之力，做了几个大鼠MCAO模型，第二天一看，个个活蹦乱跳，毫无脑缺血症状，当场晕。主要原因是栓线插入深度不够，即栓线的前端未进入大脑前动脉（ACA），拴线的粗细倒是次要的，0.20-0.26mm均可。因此，保证栓线进入ACA并阻断对侧来的血流，而又不刺破血管是重中之重。
秘诀1：许多文献报道插入深度为18.5+-0.5mm（270g左右大鼠），如果按这一标准去做，而不考虑大鼠的个体差异，后果是缺血的程度参差不齐，很多大鼠会出现症状较轻，甚至无症状。我的建议是当插线近18mm（做上标记）时，注意手的感觉，轻缓推进，直至感觉到阻力为止（当遇到阻力后，再插线会见到线弯曲）。可能有人会说，把血管插破了也未感觉到阻力或线遇阻后的弯曲。一个原因是线太硬，另一主要原因是当栓线从血管切口插入后为防止血液从此处流出，需要结扎一条细线，这条线结扎的松紧程度很关键，应在不流血的情况下尽可能的松，这样你会发现进线时很轻松，一旦遇到阻力，就会感觉到。后者至关重要，请体会。
秘诀2：栓线一旦进入ACA，就要把上面提到的那根细线适度扎紧（“适度”很重要，会影响到再灌流时大鼠的生死存亡），此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。

4.制备线栓法脑缺血模型（MCAO）时如何舍去不合理的动物！

理想的脑缺血动物模型应满足的条件是：脑缺血程度的个体间变异小、手术简单、创伤小、其病理生理变化接近于临床，其中脑缺血程度的稳定最为关键。栓线法大鼠MCAO模型，是目前最符合上述条件的脑缺血动物模型，在国际上已被广泛采用。但仍有很多因素可影响该模型缺血程度的稳定，如动物体重、栓线的直径及插入深度、肝素的使用等。即使严格控制了这些影响因素，仍然会遇到有的动物无脑缺血症状或症状很轻，有的动物症状很重或死亡，显然这不是药物干预的结果。如果对动物不加取舍，数据的标准差就会很大，需要每组的动物例数足够多（多的难以接受），才能得到正确的统计结果。如果盲目地、无标准的舍去某些动物，主观意志会使结果出现假阳性。因此必须建立对模型动物的较客观的取舍标准，以下是本人在线栓法(直径0.24mm)MCAO/Reperfusion实验中采用的标准（SD大鼠，体重250-290g），希望和大家共同探讨。
舍去标准：
⑴栓线插入深度不足18.5 mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠, 因为这和栓线没有完全阻断ACA的血流有关，属于手术失败，不可能是药物治疗的结果。
⑵蛛网膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion损伤。
（3）手术时出血较多，症状很重的动物。
这些措施可在一定程度上降低动物个体间脑缺血程度的差异。

5.大鼠脑切片TTC染色后的照相技巧

提到照相，大家自然会想到照相机，用胶卷照相机近摄，需专业技巧，照完后不能立即见到结果。用数码照相机，相对方便多了，但价格不菲，而且每次照相时放大倍数难以固定、光线明暗度不同，把每次的照片组合在一起时，不协调。本人推荐的方法是用扫描仪照相，不用调焦、不用调光、以固定比例扫描，精度高。方法如下：

大鼠迅速断头、取脑（此过程不超过3 min），-20℃冷冻约15 min。待其稍变硬时，从冰箱取出，用切片机将两侧大脑半球切成厚1.5 mm的冠状切片（每只大鼠脑可切7-8片），浸泡于10 ml 1%的TTC磷酸缓冲液中（0.2 M, pH 8.7），37℃避光孵育约15 min，此间将脑片的上下面翻转至少一次，以便两面染色一致，正常脑组织染为深红色，脑梗死区不染色（灰白色）。然后将脑片浸泡于1.5%多聚甲醛磷酸缓冲液（0.2 M, pH 7.4）内，4℃固定24 h后（最好不超过72 h,以免褪色），将每只大鼠的所有脑片按脑的前后顺序从左至右整齐排列在投影胶片上，将胶片放在扫描仪上，在脑片上轻轻放一块儿蓝色背景，注意不要使脑片移位。盖上扫描仪盖子，扫描即可。

6.如何提高MCAO的成活率！！！

首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太重，需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。永久MCAO的死亡率要高于短暂MCAO，其实永久MCAO没必要观察24h，6hMCAO的脑梗死体积已接近24h，此时，很少有动物死亡。

7.10分钟完成大鼠MCAO模型的利器——制作微血管电凝器

现在我告诉大家10分钟完成MCAO模型的技巧之一——制作微血管电凝器。
如果手术中把遇到的每个血管都用线结扎并从中间剪断，需要分离较长的一段血管，而且结扎的两线不能离得太近，这是很繁琐和费时的，有些血管只需离断即可，用血管电凝器可做到，但市场上没有合适的这种设备，只好自己制作：找一段直径0.5mm长约5-10cm的电阻丝（电褥子里面有）对折呈U字型，间隔约1-2mm，将U的上端分别通过两根导线和变压器相连，将变压器输出电压从0开始缓慢加大，直至电阻丝加热到开始微微发红，这就确定了工作电压，一般在5V左右,也可根据确定的电压用干电池替代变压器更方便安全，在电路上加一微型按压式开关；将U的下端面向面对或背对你的方向弯成一钩状。这就是电凝器的工作原理，至于两线之间的绝缘处理及外观如何自己想办法，我是做成签字笔型的，开关镶嵌在笔的侧壁。使用时只需血管分离很短的一段，用电凝器将血管勾出，按下开关烧断即可。我手术时分离的枕动脉、甲状腺动脉都是烧断的，颈外动脉远心端单线结扎后，在结扎线外勾出血管烧断。现在对我来说没这种工具是万万不行的。
至于那根很深的翼颚动脉，我是置之不理的，因为我有更好的办法对付它(见2)。

8. 排水法测定脑梗死体积 
采用我们建立的脑梗死体积排水测定法[20]，并进一步改进。在一带盖的平皿内，叠放三张浸泡过1.5%多聚甲醛磷酸缓冲液的滤纸。将大鼠脑片的左右半球沿正中分离，沿TTC染色界线用手术刀片仔细将左半球脑片梗死区部分剥离。将待测大鼠脑片置滤纸上，盖上平皿的盖，以保证每个脑片表面湿润程度的一致，即避免脑片表面有过多的液体或因液体蒸发使表面干燥。测右半球脑片的总体积和左半球脑片正常脑组织的总体积，二者之差即为脑梗死体积。具体过程简言如下(Fig.1-3)：⑴打开容量瓶C的盖子并注入4/5体积的脑组织固定液。调节三通F、启动微量泵，通过注水管D分别将测量管A、B（精度为1 mm3）装满固定液，液面以刚超过的球状膨大处为好，不要进入和测量管上端相连的硅胶管内。在容量瓶内补加液体达4/5体积，盖严瓶盖，反向启动微量泵，分别将测量管内液体排入容量瓶。容量瓶注满液体后，多余的液体从排水管E排出。最终使测量管A、B的液面处于0刻度或稍高位置，分别为X1、Y1，E管的液面达某一刻度。⑵调节三通阀门F使A和D断开、B和D相通，启动微量泵使C内的液体进到B内。打开瓶盖，放入待测脑片，然后盖严瓶盖，此过程不要丢失任何液体。反向启动微量泵，使B内液体缓慢进入C，待C内液体注满，且E管液面达调定刻度，停止微量泵。此时，若B管的液面刻度为Y2,则Y2-Y1即为被测脑组织的体积。如B管的液面超过最高刻度，则调节F使A和B相通，将B管液体排入A,直到B管的液面降至最高刻度以下。此时，若B管的液面刻度为Y2，A管的液面刻度为X2,则(Y2-Y1)+(X2-X1) 即为被测脑组织的体积